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在这十几年中，李时珍阅读了大量古医籍，又经过临床实践发现古代的本草书籍，“品数既烦，名称多杂。或一物析为二三，或二物混为一品”（《明外史本传》）。特别是许多毒性药品，竟被认为可以“久服延年”，因而遗祸无穷。于是，他决心要重新编纂一部本草书籍。三十一岁那年，他就开始酝酿，为了“穷搜博采”，读了大量参考书。家藏的书读完了，就利用行医的机会，向本乡豪门大户借。后来，进了武昌楚王府和北京太医院，读的书就更多，简直成了“书迷”。他自述“长耽嗜典籍，若啖蔗饴”（《本草纲目》原序）。顾景星在《李时珍传》里，也赞他“读书十年，不出户庭，博学无所弗瞡”。确实如此，他不但读了八百余种上万卷医书，而且看过不少历史、地理和文学名著，敦煌的经史巨作，他遍读了；几个古代伟大诗人的全集也都仔细钻研过。他还摘录了大量有关医药学的诗句。这些诗句给了他许多真实有用的医药学知识，帮助他纠正了前人在医药学上的许多谬误。如古代医书中，常常出现“鹜与凫”。它们指的是什么？是否有区别？历代药物学家众说纷纭，争论不休。李时珍摘引屈原《离骚》中的“将与鸡鹜争食乎”，“将泛乎若水中之凫乎”两句，指出诗人把“鹜”与“凫”对举并称，就是它们不是同一种禽鸟的明证。他又根据诗中对它们不同生活环境的描绘，证明“鹜”是家鸭，“凫”是野鸭子，药性不同。屈原的诗赋，竟成了李时珍考证药物名实的雄辩依据。
在编写《本草纲目》的过程中，最使李时珍头痛的就是由于药名混杂，往往弄不清药物的形状生长的情况。过去的本草书，虽然作了反复的解释，但是由于有些作者没有深入实际进行调查研究，而是在书本上抄来抄去在“纸上猜度”，所以越解释越糊涂，而且矛盾倍出，使人莫衷一是。例如药物远志，南北朝著名医药学家陶弘景说它是小草，象麻黄，但颜色青，开白花，宋代马志却认为它象大青，并责备陶弘景根本不认识远志。又如狗脊一药，有的说它象萆薢，有的说它象拔葜，有的又说它象贯众，说法很不一致。类似此情况很多，李时珍不得不一次又一次搁下笔来。这些难题该怎样解决呢？在他父亲的启示下，李时珍认识到，“读万卷书”固然需要，但“行万里路”更不可少。于是，他既“搜罗百氏”，又“采访四方”，深入实际进行调查。
李时珍穿上草鞋，背起药筐，在徒弟庞宪、儿子建元的伴随下，远涉深山旷野，遍访名医宿儒，搜求民间验方，观察和收集药物标本。他首先在家乡蕲州一带采访。后来，他多次出外采访。除湖广外，还到过江西、江苏、安徽好多地方。均州的太和山也到过。盛产药材的江西庐山和南京的摄山、茅山、牛首山，估计也有他的足迹。后人为此写了“远穷僻壤之产，险探麓之华”的诗句，反映他远途跋涉，四方采访的生活。
李时珍每到一地，就虚心向各式各样的人物请求。其中有采药的，有种田的，捕鱼的，砍柴的，打猎的。热情地帮助他了解各种各样的药物。
比如芸苔，是治病常用的药。但究竟是什么样的？《神农本草经》说不明白，各家注释也搞不清楚。李时珍问一个种菜的老人，在他指点下，又察了实物，才知道芸苔，实际上就是油菜。这种植物，头一年下种，第二年开花，种子可以榨油，于是，这种药物，便在他的《本草纲目》中一清二楚地注解出来了。
在四处采访中，或在自己的药圃里，李时珍都非常注意观察药物的形态和生长情况。蕲蛇，即蕲州产的白花蛇。这种药有医治风痹、惊搐、癣癞等功用。李时珍早就研究它。但开始，只从蛇贩子那里观察。内行人提醒他，那是从江南兴国州山里捕来的，不是真的蕲蛇。那么真正蕲蛇的样子又是怎么样的呢？他请教一位捕蛇的人。那人告诉他，蕲蛇牙尖有剧毒。人被咬伤，要立即截肢，否则就中毒死亡。在治疗上述诸病有特效，因之非常贵重。州官逼着群众冒着生命危险去捉，以便向皇帝进贡。蕲州那么大，其实只有城北龙峰山上才有真正的蕲蛇。李时珍追根究底，要亲眼观察蕲蛇，于是请捕蛇人带他上了龙峰山上。那里有个狻猊洞，洞周围怪石嶙峋，灌木丛生。缠绕在灌木上的石南藤，举目皆是。蕲蛇喜欢吃石南藤的花叶，所以生活在这一带。李时珍置危险于度外，到处寻找。在捕蛇人的帮助下，终于亲眼看见了蕲蛇，并看到了捕蛇、制蛇的全过程。由于这样深入实际调查过，后来他在《本草纲目》写到白花蛇时，就得心应手，说得简明准确。说蕲蛇的形态是：“龙头虎口，黑质白花、胁有二十四个方胜文，腹有念珠斑，口有四长牙，尾上有一佛指甲，长一二分，肠形如连珠”；说蕲蛇的捕捉和制作过程是：“多在石南藤上食其花叶，人以此寻获。先撒沙土一把，则蟠而不动，以叉取之。用绳悬起， 刀破腹去肠物，则反尾洗涤其腹，盖护创尔，乃以竹支定，屈曲盘起，扎缚炕干。”同时，也搞清了蕲蛇与外地白花蛇的不同地方：“出蕲地者，虽干枯而眼光不陷，他处者则否矣。”这样清楚地叙述蕲蛇各种情况，当然是得力于实地调查的细致。
李时珍了解药物，并不满足于走马看花式的调查，而是一一采视，对着实物进行比较核对。这样弄清了不少似是而非、含混不清的药物。用他的话来说，就是“一一采视，颇得其真”，“罗列诸品，反复谛视”
当时，太和山五龙宫产的“榔梅”，被道士们说成是吃了“可以长生不老的仙果”。他们每年采摘回来，进贡皇帝。官府严禁其他人采摘。李时珍不信道士们的鬼话，要亲自采来试试，看看它究竟有什么攻效。于是，他不顾道士们的反对，竟冒险采了一个。经研究，发现它的功效跟普通的桃子、杏子一样，能生津止渴而已，是一种变了形的榆树的果实，并没有什么特殊攻效。
鲮鲤，即今天说的穿山甲，是常用的中药。陶弘景说它能水陆两栖，白天爬上岩来，张开鳞甲，装出死了的样子，引诱蚂蚁进入甲内，再闭上鳞甲，潜入水中，然后开甲让蚂蚁浮出，再吞食。为了了解陶弘景的说法是否对头，李时珍亲自上山去观察。并在樵夫、猎人的帮助下，捉到了一只穿山甲。从它的胃里剖出了一升左右的蚂蚁，证实穿山甲动物这点，陶弘景是说对了。不过，从观察中，他发现穿山甲食蚁时，是搔开蚁穴，进行舐食，而不是诱蚁入甲，下水吞食，李时珍肯定了陶弘景对的一面，纠正了其错误之处。
就这样，李时珍经过长期的艰苦的实地调查，搞清了药物的许多疑难问题，于万历戊寅年（公元一五七八年）完成了《本草纲目》编写工作。全书约有190万字，五十二卷，载药一千八百九十二种，新增药物三百七十四种，载方一万多个，附图一千多幅，成了我国药物学的空前巨著。其中纠正前人错误甚多，在动植物分类学等许多方面有突出成就，并对其他有关的学科（生物学、化学、矿物学，地质学，天文学等等）也做出贡献。达尔文称赞它是“中国古代的百科全书”。
明世宗即位四十几年，尽情享乐，但是他又担心自己一天天衰老下去，有朝一日死掉，
快活日子就过不下去。于是，他就千方百计寻找一种长生不老的药方。
公元１５５６年，朝廷下令各地官吏推荐名医。当时封在武昌的楚王，把正在王府里的
医生李时珍荐给太医院。李时珍是蕲州（今湖北蕲春，蕲音ｑ）人。他的祖父、父亲都当
过医生。父亲李言闻对药草很有研究，李时珍从小受父亲的影响，常常跟小伙伴一起上山采
集各种药草。日子一长，他能认得各种草木