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直由细菌战的积极鼓吹者和支持者隆二担任。同时，731部队的最终决策权属于日本参谋本部。其所需科研人员、设备、原料等都由参谋本部直接掌管，细菌战的研究、生产及其成果等，均由关东军上报给参谋本部（或大本营）最后裁定。它的配备也与其他部队不同，人员级别高、机构庞大、设施先进。其中，有中将1名，少将4名、校官（佐级军官）80余名、判任官（委任官）和技师300 余名。731部队堪称日军中开支最大，待遇最优厚，学者最多，技术力量最强的部队，除部队自身的专家外，满洲医科大学等科研机构的许多学者、专家也无一不在其收罗之中。
731部队的部队长，1936年至1942年7月为石井四郎少将（后晋升为中将）；1942年8月至1945年2月为北野政次少将；1945年3～8月为石井四郎中将。731部队本部下设8个部。另外，还管辖设在孙吴、海拉尔、牡丹江、 林口等地的4个支队和设在大连的1个研究所。
8个部如下。
第一部为细菌研究部，北川大佐、菊地少将等曾任部长。第一部的主要任务是研究细菌战所需各种细菌的特性和培养、制造、使用等方法，以及实验（包括对人体实验）。该部下设从事鼠疫菌研究的“高桥班”、从事病毒研究的“笠原班”、 从事细菌传染媒介物——昆虫研究的“田中班”、从事冻伤研究的“吉村班”、从事赤痢研究的“江岛班”、从事霍乱研究的“凑班”、从事病理研究的“冈本班”和“石川班”、从事血清研究的“内海班”、从事伤寒研究的“田部班”、从事结核研究的“二木班”、从事药理研究的“草味班”、从事立克次氏体（包括跳蚤）研究的“野口班”、从事细菌对人传染适应性研究的“川上班”。
第二部为细菌实验部，初由太田澄大佐任部长。第二部的主要任务是， 在野外条件和战斗环境下，实际检验由第一部研制出的细菌的使用效能，并制造相应的细菌战等细菌武器。这个部除用动物和活人进行细菌实验外，还通过“八木泽班”从事植物病毒研究和传染试验；设置了“石井”动物饲养班和培殖细菌传染媒介物的分部；在正黄旗三屯西南城小沟设立了临时实验场，在安达镇东35华里的鞠家窑附近设置了靶场；还有为细菌实验服务的“航空班”、“无线电班”和“气象班”。
第三部，为防疫给水部，江口中佐任部长。这个部设在哈尔该市内的原“加茂部队”的旧址“南栋”。731部队本部迁往平房后，它改为第三部。其任务是负责关东军所属各部队的用水检查和消毒事项。它辖有滤水器制造厂和在哈尔该西郊杨马架子的秘密生产土陶瓷的“石井式”细菌弹壳制造厂；以及在平房的各类细菌武器的研制场所。
第四部，为细菌生产部，川岛清少将任部长。第四 部是名副其实的细菌生产工厂，经过研制，实验所取得的效果，都在这里进行培养和生产。该部初期设4 个生产课，1943年合并为两个分部。每个分部按照各自的分工独立进行多类细菌的制造，由柄泽班、有田班、朝北奈班和山口班完成从细菌繁殖到细菌武器装配的全套工序。其每月生产能力为培养各种细菌200～300公斤。
总务部，部长初期由中留中佐担任，后期由太田澄大佐担任。该部是731部队的中枢部门，权力很大，不仅负责整个部队的文秘、人事、财务、计划、后勤和劳工管理等工作，还负责与宪兵队联系和接收供细菌战实验使用的囚犯。它下设调查课，包括秋贞班、调查班、庶务班、兵要地志班、照明班、印刷班、电报室、图书室、邮政所；管理课，包括劳务班、工务班、建设班；庶务课，包括动力班、酒保、食堂、宿舍等；还有人事课、会计课、企画课、标本陈列室。其中，劳务班是管理、监督、调配中国劳工的机构。731部队从营建开始，日伪当局就从哈尔滨、阿城、海伦、佳木斯、牡丹江以及锦州、大石桥、海城等地强征和招骗了一批又一批劳工，在这里从事奴隶般的劳役。据调查， 在731部队盘踞平房的9 年间， 强征来的劳工达5000余人。在它的种种非人虐待和残酷迫害之下，除2000名本地劳工幸存外，其余3000多名外地劳工基本上都悲惨地死在这个魔窟里了。
训练教育部，部长初期由园田大佐担任，后期由西俊英中佐接任。它是专门培训从事细菌研究、实验生产和使用细菌武器人员的部门。下设卫生兵教育队、特种人员训练队、少年队等。据西俊英供述，自1944年以后， 每年都要为关东军部队至少要培养300名善于使用细菌武器的专门人才。前陆军审判材料。
器材供应部，部长由大谷少将担任。它除了负责生产细菌武器的各种器材、设备的贮存与供应外，还担负着实验动物的运输及各类菌苗、疫苗的贮存任务。下设第一、第二仓库和兵器库、菌苗库、血清库等。
诊疗部，部长由永山大佐担任。它负责日本人的疾病预防和治疗；设有诊疗室，日本军人家属医院等。佟振宇认为，诊疗部不是治疗一般疾病的部门。它是为在培植细菌过程中，不慎感染细菌的人进行抢救而设立的。因此，在魔窟内即使是日本人也要写保证书，保证将遗体交总部“处置”。佟振宇：《日军侵华与细菌战罪行录》第92页。
另外， 还有一个与各部平行的管理监狱的“特别班”由石井四郎的二哥石井刚男掌管。
德国侵苏战争爆发以后，德、意、日3国结成同盟，日本企图建立所谓“大东亚新秩序”。基于这一战略目的，它进一步加紧细菌战的准备。1940年12月2日，日本天皇裕仁又发布了敕令， 要求在进攻苏联的各个战略要地建立细菌战基地，即建立731部队的各个支队，扩大731部队及其细菌武器的生产。据此在由日军大将、首相、陆相东条英机签署的《关于建立和分布石井部队4个支队的命令》中说，“在石井部队下， 分设有许多交由日本关东军各部队和各兵团指挥的支队，它们的任务是准备在战争中，实际使用该部队的细菌武器。”其附件中，日军参谋本部对建队的时间、驻地以及配置人数都提出了要求，规定每个支队名额为300人，并指示各支队可以接纳雇员， 雇员人数不得超过各支队全员的30％。据此，731部队在海拉尔、孙吴、牡丹江、林口等地分别建立了4个支队， 1941年8月， 号称“关东军防疫给水部”的石井部队及其各支队改用了秘密番号：本部为731部队，海拉尔支队为543支队，孙吴支队为673支队，牡丹江支队为643支队，林口支队为162支队。海拉尔支队，支队长为加藤恒则少佐；驻在海拉尔市西南15公里处， 有从事细菌研究、实验的日本人员226名。由于该支队地处内蒙草原，所以海拉尔支队成为供应细菌和实验用黄鼠的大户，储有黄鼠3万只以上。另外，该部队还经常与第100部队共同进行细菌战研究。佟振宇：《日军侵华与细菌战罪行录》第112页。孙吴支队，支队长先后由佐佐木少佐，西俊英中佐担任。它驻在孙吴镇西山，有从事细菌研究、实验的日本人员136名。有材料证明，早在1933年春，关东军就在孙吴建立了细菌部队，时称2645部队。该部队曾进行了细菌战的实验，并以活人为实验对象。佟振宇：《日军侵华与细菌战罪行录》第49页。牡丹江支队，又称海林支队，支队长为尾上正男少佐。它驻在海林县海林镇东北的后腰屯（今福利屯），设总务部、第一部（培殖老鼠和跳蚤）、第二部（细菌研究）、供给部、训练部，有从事研究、实验的日本人员200名。林口支队，支队长为木神原秀夫少佐。它驻在林口县的林口镇和古城镇之间，设总务课（计划、经理、庶务）、第一课（细菌传染的研究和动物的培养）、第二课（防疫给水研究）、资材课（各类器材和物品的保管）， 有研究、 实验的日本人员226名。
这样的战略布局，不仅可以按品种、数量扩大细菌武器的生产， 发挥各支队直接进行细菌攻击的作用，而且还能在战局不利，哈尔滨的731部队本部或者某一支队遭到毁灭性打击时，使细菌战不受到根本性的影响。因此，石井四郎到海拉尔543支队视察时说：“日、苏战争迟早难免，因此我军亦在生物化学战上，应特别提高自己职能涵养；对于细菌战，我们是有信心的。”“为避免�